Влияние плазмалогенов (Tamotsu/Тамоцу) на системную индуцированную липополисахаридом глиальную активацию и накопление β-амилоида у взрослых мышей

Ann. N.Y. Acad. Sci. ISSN 0077-8923

ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES

Выпуск: Neuroimmunomodulation in Health and Disease

Влияние плазмалогенов Tamotsu/Тамоцу на системную индуцированную липополисахаридом глиальную активацию и накопление β-амилоида у взрослых мышей

Тосихико Катафучи,1Масатака Ифуку,1Широ Маватари,2Мами Нода,3Кийотака Миаке,4Масааки Сугияма,4 и Такехико Фудзино2

1Кафедра интегративной физиологии, Высшая школа медицинских наук Университета Кюсю, Fukuoka 812-8582, Japan. 2Институт реологической функции питания, Kasuya-gun, Fukuoka, Japan. 3Лаборатория патофизиологии, Высшая школа фармацевтических наук, Университет Кюсю, Fukuoka, Japan. 4Центральный исследовательский институт, Marudai Food Co. Ltd., Osaka, Japan

Адрес для корреспонденции: Toshihiko Katafuchi, M.D., Ph.D., Department of Integrative Physiology. Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, Fukuoka 812-8582, Japan, kataf@physiol.med.kyushu-u.ac.jp

Нейровоспаление заключается в активации глиальных клеток в качестве причины/следствия нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (БА). Плазмалогены (Pls) являются глицерофосфолипидами, образующими клеточные мембраны, и имеют важное значение для текучести мембран и клеточных процессов, таких как везикулярное слияние и передача сигналов. Внутрибрюшинные (i.p.) инъекции липополисахарида (LPS, 250 мкг/кг) в течение 7 дней приводили к морфологическим изменениям и увеличение числа микроглий Iba-1+ с признаками нейровоспаления в гиппокампе взрослых мышей. LPS-индуцированная активация глиальных клеток значительно ослаблялась предварительной внутрибрюшинной инъекцией Pls, растворенных в кукурузном масле. Кроме того, системное поступление LPS-индуцированных нейронов Аβ1-16+ в гиппокамп также прекращалось при введении Pls. Наконец, содержание Pls в гиппокампе уменьшалось после введения LPS, однако снижение уровня могло быть подавлено путем введения Pls. Эти результаты указывают на антиамилоидогенетическое действие Pls и возможное терапевтическое применение Pls при БА.

Ключевые слова: нейровоспаление; фосфолипиды; микроглии; болезнь Альцгеймера

doi: 10.1111/j.l 749-6632.2012.06641 .x

Ann. N.Y. Acad. Sci. 1262 (2012) 85-92 © 2012 New York Academy of Sciences.

Введение

Установлено, что системное введение липополисахарида (LPS), лиганда Toll-подобного рецептора (TLR) 4, индуцирует ухудшение когнитивного поведения у мышей.1-3 В работе (Lee et al.)2 сообщается о том, что синтез β-амилоидного белка (Aβ) и активность β-секретазы, основного ограничивающего фермента, который инициирует образование Аβ в коре головного мозга и гиппокампе, увеличивался у взрослых (но не молодых) мышей после однократной внутрибрюшинной (i.p.) инъекции LPS. Кроме того, было иммунногистохимически показано внутриклеточное накопление Aβ в пирамидальных нейронах гиппокампа после ежедневных инъекций LPS в течение 7 дней.2 Хотя точные механизмы LPS-индуцированного амилоидогенеза пока не установлены, представляется вероятным, что нейровоспаление, которое характеризуется активацией глиальных клеток и повышенной экспрессией цитокинов, хемокинов и активных форм кислорода/азота (ROS/RNS), играет важную роль, так как опосредованные глиальными клетками воспалительные реакции вызывают отложение Аβ в головном мозге.4-6

Плазмалогены (Pls) являются глицерофосфолипидами с винилэфирной связью в положении  sn-1 основной цепи глицерола. Они встречаются во всех тканях млекопитающих, особенно в сердце и мозге, в форме этаноламин-Pls (PlsEtn), которые гораздо более многочисленны, чем холин-Pls (PlsCho).7 Pls высвобождают либо докозагексаеновую кислоту (DHA), либо арахидоновую кислоту (ARA) в положении sn-2 посредством активации Pls-селективной фосфолипазы А2 (Pls-PLA2).8,9 Pls не только являются структурными компонентами мембранн и хранилищами вторичных посредников, но и участвуют в слияние мембран, ионном переносе и оттоке холестерина.7 Кроме того, винилэфирная связь в положении sn-1 делает Pls более восприимчивыми к окислительному стрессу, чем соответствующие глицерофосфолипиды с эфирными связями, превращая их в антиоксиданты и защищая клетки от окислительного стресса.10-13

Ранее было показано, что пациенты, страдающие от болезни Альцгеймера (БА), имеют пониженный уровень PlsEtn в коре головного мозга и гиппокампе.14-16 Снижение уровня PlsEtn представляется специфичным, поскольку при других нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Хантингтона и болезнь Паркинсона, не наблюдаетсяснижение уровня в соответствующих пораженных областях головного мозга (хвостатое ядро ​​и черная субстанция, соответственно).7,14,17 Кроме того, уровень циркулирующих PlsEtn также снижается в зависимости от тяжести деменции.18,19 Поэтому вполне возможно, что Pls участвуют в патологии БА. В настоящем исследовании мы изучили LPS-индуцированный амилоидогенез и предприняли попытку установить (1) воздействие плазмалогенов на нейровоспалении и накопление Аβ в гиппокампе и (2) изменения в содержании плазмалогенов в гиппокампе после периферического введения LPS у взрослых мышей.

Материалы и методы

Все эксперименты, связанные с использованием животных, были одобрены Комитетом по этике при экспериментах на животных Университета Кюсю и были проведены в соответствии с Руководящими принципами по уходу и использованию животных Физиологического общества Японии. Были приложены все усилия к тому, чтобы свести к минимуму страдания животных и количество животных, используемых в исследованиях.

Животные

Во всех опытах были использованы самцы мышей С57/6J весом 25-30 г (возраст 10 месяцев). Животных содержали в трех клетках (по пять животных в клетке) при температуре 22±2°C и цикле 12 ч света / 12 ч темноты (свет включали в 8:00) со свободным доступом к лабораторному питанию и воде. Мыши были случайным образом разделены на три группы: контрольная, LPS и LPS + Pls. LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) растворяли в физиологическом растворе, а Pls – в кукурузном масле, а затем обрабатывали ультразвуком, чтобы обеспечить полное растворение. Группе LPS делали внутрибрюшинные (i.p.) инъекции LPS (250 мкг/кг) и затем носителя Pls, кукурузного масла, ежедневно утром (9:00-10:00) в течение 7 дней до момента умерщвления. Группа LPS + Pls получала LPS и Pls (20 мг/кг), а контрольная группа получала физиологический раствор и кукурузное масло в течение 7 дней.

Получение плазмалогенов

Pls, использованные в настоящем исследовании, были получены из мыщцы куриной грудки способом, описанным ранее.20 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) для разделения фосфолипидов 21 показала, что очищенные Pls содержали 47,6% PlsEtn, 49,3% PlsCho, 2,4% сфингомиелина (SM) и 0,5% других фосфолипидов.

Иммуногистохимия и иммунофлюоресценция

Мыши были помещены в глубокий наркоз пентобарбиталом (50 мг/кг), после чего была произведена транскардиальная перфузия фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), а затем 4%-ным параформальдегидом. Мозг был удален, пост-фиксирован на 24 ч и затем последовательно перенесен в 20% и 30%-ные растворы сахарозы. Впоследствии мозг был заморожен и нарезан срезами 30 мкм с помощью криостата. Срезы пермеабилизовали 0,3% Triton-X 100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) в PBS в течение 15 минут и блокировали в PBS, содержащем 1% BSA и 5% нормальной сыворотки осла (Jackson ImmunoResearch Lab., West Grove, PA) в течение 60 минут при комнатной температуре. Срезы инкубировали в блокирующем растворе (Block Асе, Dainippon Pharmaceutical, Japan) в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем инкубировали поликлональным антителом кролика против Iba-1 (1:10000; Wako Pure Chem. Indus., Osaka, Japan), которое, как известно, имеет афинностью с микроглиальным Ca2+-связывающим белком и хорошо экспрессируется за ночь активированными микроглиями в 10% Block Ace в PBS. Другие срезы инкубировали антителами против Aβ1-16 (1:1000; Abeam, Cambridge, UK) и NeuN (1:1000; Millipore, Billerica, MA). Промытые срезы инкубировали в течение 6 ч антикроличьей сывороткой козы IgG Alexa Fluor 488 или антимышиной сыворткой козы IgG Alexa Fluor 568 (1:1000; Invitrogen, Eugene, OR) при комнатной температуре. За каждой обработкой следовала промывка три раза по 5 минут PBS. Срезы затем помещали в водную заливочную среду PermaFluor (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

Количественный анализ интенсивности флуоресценции

Все образцы были проанализированы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (LSM510 Meta, Carl Zeiss, Germany). Количество глиальных клеток в 60-80 областях размером 200 мкм × 200 мкм пяти срезов каждого мозга подсчитывали, и получали усредненное количество/4 х 104мкм2 для каждого мозга.

Измерение содержания плазмалогенов в гиппокампе и PFC 

Мыши были помещены в глубокий наркоз фенобарбиталом (50 мг/кг) и подвергнуты транскардиальной перфузии стерильным PBS. Мозг удаляли, а гиппокамп препарировали в чашку, наполненную охлажденным льдом PBS. Образцы (300-500 мг), хранили при -80°С до измерения плазмалогенов. Суммарные липиды экстрагировали по методу, описанному (Folch et al.)22, а относительный состав фосфолипидных классов, в том числе Pls, измеряли по методу, описанному ранее.21 

Статистический анализ

Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная погрешность среднего. Количество клеток Iba-1+ сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим ретроспективным анализом (Шеффе). Изменения в содержании PlsEtn и отношении PlsEtn/фосфатидил-Etn (PEtn) после инъекций LPS и Pls оценивали с помощью непараметрического теста Крускала-Уоллиса, после которого применялся критерий множественных сравнений Стила. Значения P < 0,05 признавались статистически значимыми.

Физраствор

Клетки Iba-1+ / 4×104мкм

Рисунок 1. Активация глиальных клеток после введения LPS (i.p.) и подавление путем одновременного введения Pls в гиппокамп мыши. (А) Количество Iba-1-положительных микроглий и интенсивность иммунореактивности (а, зеленый) увеличивались при введении LPS (б), которое подавлялось одновременным введением Pls (с). Масштабная линейка, 100 мкм. (B) LPS-индуцированное увеличение количества микроглий и подавление Pls (каждый столбец, n = 8). ** P < 0.01.

Физраствор

Объед.

Рисунок 2. Накопление Aβ белка после введения LPS (i.p.) и подавление одновременным введением Pls в область CA1 гиппокампа мыши. Нейроны окрашивали NeuN (красный, a-c). Небольшая флуоресценция Аβ1-16 иммунореактивности (зеленый) контрольной группы (d) усиливалась после введения LPS (е), которое полностью нейтрализовывалось Pls (f). Флуоресценция Aβ1-16 соединялась с иммунореактивностью NeuN, что указывает на внутриклеточную локализацию Аβ (g и h). Масштабная линейка, 50 мкм.

Результаты

Подавление глиальной активации Pls

Как показано на рисунке 1А-а, контрольная группа, которая получала физиологический раствор и кукурузное масло в течение 7 дней, показали типичные признаки Iba-1-позитивных (зеленый) пассивных микроглий с небольшой компактной сомой, несущей ветвистые процессы в гиппокампе. Однако внутрибрюшинное введение LPS (250 мкг/кг/день) в течение 7 дней (группа LPS) привела к нейровоспалению с увеличением количества микроглий и интенсивной иммунореактивностью, активированным фенотипом клеточной гипертрофии и ретракцией цитоплазматических процессов (рис. 1А-b). Как показано на рисунке 1А-а, увеличение количества активированных микроглий было подавлено одновременным введением Pls (20 мг/кг) (группа LPS + Pls). На рисунке 1В показано LPS-индуцированное увеличение количества глиальных клеток и подавление Pls (каждый столбец, n = 8). Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA показал существенные различия в количестве микроглий (рис. 1B; F (2,21) = 44,7, P < 0,01) между группами. Ретроспективный анализ показал, что группа LPS отличалась от контрольной группы и группы LPS + Pls (тест Шеффе, P < 0,01), однако группа LPS + Pls не имела отличий от контрольной.

Подавление Pls ЛПС-индуцированного накопления

Как показано на рисунке 2, слабая флуоресценция иммунореактивности Aβ1-16 (зеленый) в пирамидальных клетках СА1 гиппокампа в контрольной группе (рис. 2d) усилилась в группе LPS (рис. 2e) и была полностью подавлена в группе LPS + Pls (рис. 2f). Пирамидальные нейроны были окрашены NeuN (красный, рис. 2а-с), и флуоресценция Aβ1-16 преимущественно соединилась с иммунореактивностью NeuN, что указывает на внутриклеточную локализацию Aβ (желтый на рис. 2h).

Изменения в содержании плазмалогенов в головном мозге после приема LPS и Pls 

Таблица 1. Изменения содержания фосфолипидов в гиппокампе после введения LPS и Pls 


КонтрольLPSLPS + Pls
PlsEtn23.98 ±0.8020.49 ± 0.44*22.28 ±0.70
PEtn19.98 ±0.4721.87 ±0.7620.41 ±0.51
PlsCho0.51 ±0.090.40 ±0.030.47 ±0.05
PCho36.70 ±1.6339.19±0.5337.84 ±1.43
SM5.44 ±0.645.16 ±0.445.51 ±0.68
PS11.93 ±0.7911.14 ±0.4411.91 ±0.710
PI1.65±0.121.83 ±0.081.74 ±0.07

PlsEtn, этаноламин-плазмалогены; PEtn, фосфатидилэтаноламин; PlsCho, холин-плазмалогены; PCho, фосфатидилхолин; SM, сфингомиелин; PS, фосфатидилсерин; PI, фосфатидилинозитол. Приведены средние значения ± стандартная погрешность среднего (n = 5) содержания фосфолипидов в %, за исключением последней строки. * P < 0,05 по сравнению с контрольной группой (критерий множественных сравнений Стила).

Как показано в таблице 1, PlsEtn был значительно выше PlsCho в гиппокампе. Относительное содержание PlsEtn было значительно снижено инъекцией LPS (тест Крускала-Уоллиса, χ2(2) = 7,74, n < 0,05). Множественный сравнительный анализ с помощью критерия Стила показал, что содержание PlsEtn в группе LPS, но не в группе LPS + Pls, по сравнению с контрольной группой значительно снизилось (Р < 0,05, каждая группа, n = 5). Содержание других фосфолипидов не показало каких-либо существенных изменений после какой-либо из процедур.

Анализ результатов

Один из недавно предложенных возможных механизмов LPS-индуцированного амилоидогенеза заключается в том, что активность β- и γ-секретазы, которая глубоко вовлечена в амилоидогенную обработку белка-предшественника амилоида,23 возрастает в коре головного мозга и гиппокампе после системной инъекции LPS.2 Было показано, что провоспалительные цитокины, а также ROS/RNS, выделенные активированными микроглиями, увеличивают образование Аβ из-за прекращения регуляции β-секретазы мРНК и ферментативной активности.5,24 Микроглии активируются также через рецепторами продвинутого конечного продукта гликолиза (RAGE), которые связывают Aβ или индуцируют фагоцитоз Аβ, тем самым усиливая генерацию ROS/RNS и цитокинов.23 

Помимо активации глиальных клеток и накопления Аβ, мы впервые продемонстрировали, что содержание плазмалогена в гиппокампе снижалось после введения LPS (таблица 1). Возможный механизм снижения Pls при нейровоспалении может быть результатом антиоксидантных свойств Pls, которые защищают клетки от окислительного стресса. Показано, что винилэфирная связь Pls в положении Sn-1 основной цепи глицерола является мишенью для большого количества различных оксидантов, в том числе ROS/RNS,10,11,13 и что окислительный стресс преимущественно окисляет PlsEtn вместо фосфатидилэтаноламина,25,26 что приводит к нарушению везикулярного слияния в синаптосомах и высвобождению ацетилхолина.27  Это может быть, по крайней мере, частичным объяснением того, почему пациенты с БА имеют пониженное содержание Pls в головном мозге.14-16 Было высказано предположение, что аномальный липидный состав мембраны, а именно, уменьшение отношения Pls к неплазмалогеновым этаноламин-глицерофосфолипидам, приводит к нестабильности мембраны при БА, что может в совокупности с механизмом амилоидного каскада способствовать амилоидогенезу.14  Кроме того, поскольку PlsEtn являются основными эндогенными липидными компонентами, которые способствуют слиянию мембран синаптических пузырьков в связи с высвобождением нейротрансмиттера,28,29 возрастные и/или патологические изменения в содержании Pls могут играть важную роль при неврологических расстройствах, в том числе при БА.7 И действительно, доказано, что снижение уровня Pls тесно коррелирует у людей с тяжестью деменции.18,19

Ряд данных указывают на наличие причинно-следственной связи между нейровоспалением, накоплением Аβ, синтезом ROS/RNS и снижением уровня Pls. LPS-индуцированная активация β-секретазы,2 которая преимущественно локализована в богатых холестерином липидных рафтах,30,31 вызывает накопление белка Аβ. Aβ-индуцированый синтез ROS/RNS усиливает перекисное окисление липидов,32,33 что приводит к снижению уровня Pls, как упоминалось ранее. Кроме того, доказано, что повышение уровня Aβ и ROS/RNS снижает экспрессию алкил-дигидроксиацетонфосфат-синтазы, фермента, ограничивающего скорость первичного синтеза плазмалогенов, в связи с дисфункцией пероксисом, при этом Pls биосинтезируется, что приводит к снижению уровня плазмалогенов.34  Также известно, что само по себе LPS-индуцированное нейровоспаление может привести к потере Pls вследствие индукции TNF-α, подавляющей еще один ключевой фермент биосинтеза плазмалогенов в пероксисомах, глицерол-3-фосфат-O-ацилтрансферазу,35 и активирующей миелопероксидазу, которая синтезирует одну из реактивных форм, хлорноватистую кислоту (HOCl), в головном мозге для окисления Pls.36 И, наконец, Pls-PLA2, расщепляющий Pls с высвобождением DHA или ARA в позиции sn-2 глицероловой группы, возможно, активируется церамидом, синтезируемым при воспалительных процессах, и способствует снижению уровня Pls в головном мозге.9,37 

Известно, что Pls вызывает снижение способности к внутриклеточному транспорту холестерина из клеточной мембраны в эндоплазматический ретикулум, что приводит к увеличению количества холестерина на поверхности клеток.38  В то же время, известно, что на синтез и клиренс Aβ влияет метаболизм холестерина. На это указывает то обстоятельство, что вариант гена аполипопротеина Е, переносчика холестерина, рассматривается в качестве одного из основных генетических факторов риска развития БА.23,39,40  Снижение уровня холестерина ингибирует синтез Aβ,41,42 а повышение способствует секреции Aβ.39,40,43 Таким образом, в патологических условиях нейровоспаления возникает порочный круг, при котором ЛПС-индуцированное накопление Аβ снижает уровень Pls, что приводит к повышению уровня холестерина и тем самым еще более увеличивает синтез Aβ. 

В настоящем исследовании мы показали, что периферическая инъекция Pls подавляет LPS-индуцированную активацию глиальных клеток (рис. 1), накопление белка Aβ (рис. 2), а также снижение уровня PlsEtn (таблица 1) в гиппокампе. Точный механизм действия Pl пока не известен. Поскольку глиальная активации, накопление Аβ и снижение Pls вовлечены в описанный порочный круг, возможно, что эффективное восполнение Pls может нейтрализовать эти патологические нарушения. Самый важный вопрос, возможно, заключается в том, могут ли периферические Pls проникать в ткань мозга. Пока нет никаких сведений о том, что Pls непосредственно пересекают гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Поэтому нельзя исключать, что антиоксидантное действие Pls происходит вне мозга и подавляет первичное воспаление, вызванное периферическим LPS. Однако известно, что уровень Pls в сыворотке снижается одновременно с, или даже до, снижения уровня Pls в тканях мозга у пациентов с БА.18,19 Кроме того, полученные нами результаты показали, что LPS-индуцированное снижение содержания плазмалогенов в гиппокампе нейтрализуется периферическим введением Pls (таблица 1). Поэтому вполне возможно, что периферическое восполнение Pls оказывает влияние на центральную нервную систему (ЦНС).

Другой вопрос заключается в том, не являются ли активными молекулами в нашем эксперименте не сами Pls, а полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), которые Pls несут в положении sn-2. Существует ряд данных, показывающих, что n-3 ПНЖК, такие как эйкозапентаеновая кислота, DHA и производный от нее нейропротектин DI, обладают противовоспалительным и нейропротекторным действием.44-47  Кроме того, известно, что DHA подавляет синтез белка Аβ посредством множества механизмов, включая ингибирование β-/γ-секретазы и изменение распределения мембранного холестерина.48-50 Поскольку очищенные Pls, использованные в настоящем исследовании, содержат DHA и ее предшественника, альфа-линоленовую кислоту, особенно PlsEtn, вполне возможно, что DHA, полученная из PlsEtn, играет существенную роль в воздействии Pls на ЦНС. Известно, что DHA синтезируется из альфа-линоленовой кислоты, входит в состав фосфолипидов печени, а затем транспортируется в мозг посредством периферического кровообращения.51 В то же время, существуют данные о том, что фосфолипиды лизо-типа, которые содержат DHA в положении sn-2, характеризуются преференциальным по отношению к DHA проникновением через лабораторную модель ГЭБ.52 Эти данные свидетельствуют о том, что Pls-содержащая DHA более эффективна с точки зрения воздействия на ЦНС, чем DHA как таковая.

Настоящее исследование показывает, что периферическое введение Pls, методики экстракции которых были недавно разработаны,20,21  может подавлять нейровоспаление в головном мозге. Хотя необходимы дальнейшие исследования механизмов воздействия на ЦНС, в том числе путей поступления в мозг, настоящие результаты указывают на возможность использования Pls в новой профилактической/терапевтической стратегии при лечении болезни Альцгеймера.

Благодарности

Настоящее исследование было проведено благодаря исследовательским грантам (22590225), предоставленными Т.К. Министерством образования, культуры, спорта, науки и техники Японии.

Конфликт интересов

У авторов отсутствует конфликт интересов.

Полезное

Tamotsu в профилактике синдрома хронического информационного истощения

Tamotsu в профилактике синдрома хронического информационного истощения Как известно, в последнее время в современном обществе стали все чаще говорить о синдроме хронического информационного истощения (в

Полезное

Что такое plasmologen (плазмалоген)

Что такое plasmologen Термин «плазмалогены» (ПГ), как известно, применяется достаточно давно для обозначения класса глицерофосфолипидов (таких как этаноламин- и холинсодержащих), отличительной особенностью строения которых является